Terapia Epigenomica de Demencia Vascular Tipo CADASIL.

 Tema: La actividad de la histona desacetilasa regula selectivamente la diferenciación del músculo liso mediada por Notch en las células vasculares humanas

Mecanismo epigenómico tratado: acetilación y desacetilación de histonas mediante as enzimas de la familia de las histonas desacetilasas (HDAC)

Cómo se lo hizo : primero se hizo un cultivo de celulas musculares lisas humanas y de fibroblastos, se utilizo reacivos como la tricostatina A (TSA) y el dimetilsulfóxido eran de Sigma Aldrich y el inhibidor de HDAC, posteriormente se realizo PCR de transcripción inversa cuantitativa e inmunotransferencia; se procedio al Silenciamiento de genes con ARNip; para finalmente hacer Transfecciones transitorias y ensayo de luciferasa.


Resultados: la inhibición de histonas desacetilasas (HDAC) antagonizó la capacidad de Notch para aumentar los niveles de α-actina de músculo liso, calponina1, músculo liso 22α y cadena pesada de miosina de músculo liso. Sin embargo, la inhibición de la actividad de HDAC no suprimió la activación de Notch de los genes diana de HRT. De hecho, la inhibición de HDAC aumentó la activación de la vía Notch mediada por el factor de unión del promotor C canónico 1 (CBF-1), que activa la transcripción de la hormonal liberadora de tirotropina (TRH)

LINK: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3487326/ 

Técnicas de Edición de Acidos Nucléicos en demencia vascular tipo CADASIL

 Tema: La omisión natural del exón NOTCH3 atenúa la agregación de la proteína NOTCH3 y la gravedad de la enfermedad en pacientes con CADASIL

Tipo de Edición: Ex vivo

Dirigidas hacia: cisteína NOTCH3 exón 9 ~ 300 pb

Dirigidas por: a nivel de ARN usando ASO y a nivel de ADN usando la edición de genes mediada por CRISPR / Cas9.

Uso de Vectores: pSQT1313

Órgano/célula a tratar: vasos sanguíneos del cerebro

Vía de administración: inyección intratecal

Resultados a corto, mediano y largo plazo: proporcircionar evidencia en humanos de que la omisión del exón NOTCH3 correctora de cisteína se asocia con una agregación de ECD de NOTCH3 vascular mínima y un fenotipo de aparición tardía relativamente leve. Estos hallazgos respaldan los esfuerzos continuos en el desarrollo de la corrección de cisteína NOTCH3 para el tratamiento de pacientes con CADASIL.

link: https://academic.oup.com/hmg/article/29/11/1853/5650455#205726017 

Terapia con Stem Cells en Demencia Vascular tipo CADASIL

 Para la enfermedad CADASIL aun no existe cura, ni tratamientos efectivos, aun se esta han realizado estudios con Celulas madre plruripotentes inducidas: para modelar enfermedad y asi proporcionar pistas valiosas para el análisis patógeno y el desarrollo de estrategias terapéuticas (1), para avanzar conocimiento de esta condición genética y la demencia vascular en general, y contribuir al desarrollo futuro de nuevas terapias.(2), para proporcionar una herramienta poderosa para estudiar los efectos de NOTCH3 en el desarrollo humano y la fisiopatología de la enfermedad de CADASIL.(3). 

Un estudio de diciembre de 2019 proporciona evidencia que muestra que la reparación cerebral mejorada por factor de células madre y factor estimulante de colonias de granulocitos (SCF + G-CSF) en ratones está mediada por la regeneración cerebrovascular regulada por VEGF-A. Los hallazgos de este estudio arrojan luz sobre cómo los factores de crecimiento hematopoyético, SCF + G-CSF, restringen la progresión patológica de CADASIL.(4)

Articulo 1

Tipo de celula madre: iPSC  y WT iPSC

Metodo de obtencion: Las iPSC se generaron mediante la electroporación de fibroblastos

Resultados: generacion de  los principales componentes celulares de los medios vasculares (VSMC) y la íntima (VEC)

Usos: descubrió nuevos fenotipos celulares asociados con enfermedades y cambios en la expresión génica, lo que generó pistas para futuras investigaciones de patogénesis, sino que también proporcionó estrategias terapéuticas potenciales para CADASIL.

link:

1.https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-019-0608-1

2.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671119303650

3.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1873506120301239

4.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996119302293

UN ejemplo de recombinaciòn de ácidos nucleicos en la naturaleza (sin manipulación del hombre) y UN ejemplo de ADN recombinante artificial en Demencia Vascular tipo CADASIL y un ejemplo de transgénico animal o vegetal

Recombinaciòn de ácidos nucleicos en la naturaleza

Ralstonia solanacearum es una bacteria que es un patógeno vegetal del suelo, responsable de la enfermedad del marchitamiento bacteriano. Su inusual amplia variedad de hospedadores (más de 250 especies de plantas), su agresividad y su amplia distribución geográfica han hecho de esta bacteria el principal modelo fitopatógeno de la clase beta-Proteobacteria. Muchas cepas de R. solanacearum tienen la capacidad de internalizar ADN exógeno a través de la transformación natural.(1)

 ADN recombinante artificial en Demencia Vascular tipo CADASIL

La proteína A1 de requerimiento de alta temperatura (HTRA1), la proteasa extracelular mutada en CARASIL, estaba fuertemente enriquecida y se colocaliza con los depósitos de ECD de Notch3 en los vasos del paciente, lo que sugiere un proceso de secuestro.

Para el analisis se utilizo proteínas HTRA1 y HTRA1S328A recombinantes utilizadas en algunos ensayos se purificaron mediante tecnología HaloTag esencialmente como se describió anteriormente  y se aplicaron a una concentración final de 100 nM. Para algunos experimentos se usó un inhibidor específico de HTRA1 (NVP-LBG976, Novartis) a una concentración final de 5 µM. (2)

CEMIP cleavage by HTRA1-containing media or by recombinant HTRA1 (100 nM) in the presence or absence of a HTRA1-specifc inhibitor (5 µM)

Transgénico animal o vegetal

Utilizando un modelo de ratón transgénico de CADASIL (TgNotch3R90C), este estudio revela nuevos hallazgos para comprender la patogénesis de CADASIL que la disminución del factor de crecimiento endotelial vascular cerebral (VEGF / VEGF-A) está relacionada con la reducción de la densidad de los vasos sanguíneos cerebrales. (3)

Links:

1. https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-7604-1_16

2. sci-hub.tw/10.1007/s00401-018-1853-8

3. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996119302293 

Técnica molecular epigenómica para Demencia Vascular tipo CADASIL

Análisis de metilación del ADN del promotor OCT4 en iPSCs WT y CADASIL. Los círculos abiertos y cerrados indican dinucleótidos CpG no metilados y metilados, respectivamente

Secuenciación de bisulfito del promotor OCT4

El ADN genómico se extrajo con el kit Qiagen Blood and Tissue. La modificación del ADN genómico con bisulfito se llevó a cabo utilizando el kit de modificación de ADN rápido CpGenome (Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento genómico modificado del promotor OCT4 se amplificó usando LA Taq Hot StartVersion (TAKARA) como se describió anteriormente  A continuación, los productos de la PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR (Qiagen) y posteriormente se clonaron en el vector pMD20 T (TAKARA). Se secuenciaron siete clones de cada muestra. Los cebadores usados para la PCR: me- OCT4 cebador directo, ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT, me- OCT4 cebador inverso, CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC.

link: https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-019-0608-1

Prueba de tamizaje y una confirmatoria para Demencia Vascular tipo CADASIL

El diagnóstico de CADASIL se realiza sobre la base de una imagen clínica típica y las características de una imagen de resonancia magnética (IRM) del cerebro y se confirma mediante la biopsia (del nervio sural, los músculos y la piel), así como por una genética análisis 

Tamizaje

La arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) es un trastorno vascular sistémico hereditario. El material osmiófilo granular (GOM) es su marcador ultraestructural. Revisamos las biopsias de piel, músculo esquelético, riñón y tejido de pericardio de 13 pacientes de pacientes con CADASIL para establecer si las observaciones ultraestructurales aclarar el mecanismo patogénico de CADASIL mediante el GOM. 

Se demuestra que los depósitos de GOM pueden tener una morfología no uniforme y describe en detalle un halo de electrones que rodea varios de ellos. Es concebible que el halo sea la evidencia morfológica y posiblemente la causa de un procesamiento aberrante de NOTCH 3, para la sospecha que está involucrado con  CADASIL.(1)

Confirmatoria

El diagnóstico y el seguimiento en pacientes con CADASIL se basan principalmente en los hallazgos de la resonancia magnética. La neuroimagen muestra WMH, infartos lacunares y CMB. Las lesiones de WMH tienden a ser simétricas y bilaterales, distribuidas en la sustancia blanca periventricular y profunda. El lóbulo temporal anterior y las cápsulas externas son sitios de predilección por WMH, con mayor especificidad de afectación del lóbulo temporal anterior. Los infartos lacunares en CADASIL se localizan dentro del centro semioval, el tálamo, los ganglios basales y la protuberancia. El número de infartos lacunares es un importante predictor de deterioro cognitivo en pacientes con CADASIL.(2)

Link:

1.  https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/brb3.624

2.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4365670/ 

Prueba de hibridación o de secuenciación para demencia vascular tipo CADASIL

- La secuenciación de Sanger para NOTCH3 identificó posibles mutaciones causales en el 10,8% de las pruebas realizadas . Se identificó que todas las mutaciones potenciales que causan la enfermedad son heterocigotas con mutaciones localizadas en el exón 4, 3, 11, 18 y 19

- El panel personalizado del gen NGS 5 identificó mutaciones en el 15.8% de los pacientes examinados para CADASIL a través de NOTCH3 , CACNA1A y ATP1A2 Esto incluía 52 muestras que habían sido probadas previamente por secuenciación de Sanger y en las que no se habían identificado mutaciones causales.

link: https://link.springer.com/article/10.1186/s40246-019-0255-x